Introducción: Las aminoacidemias son enfermedades metabólicas caracterizadas por un exceso de aminoácidos y ácidos orgánicos en fluidos biológicos. Estas enfermedades son causadas por un déficit enzimático en el metabolismo de aminoácidos y presentan manifestaciones clínicas heterogéneas y severidad variable. El diagnóstico precoz de la entidad específica es crucial. Objetivos: Validar un método por HPLC en fase reversa con derivatización pre-columna con fenilisotiocianato de sodio para la cuantificación simultánea de 13 aminoácidos en suero, con vista a emplearlo en el diagnóstico de aminoacidemias. Materiales y Métodos: Los parámetros de validación evaluados fueron: especificidad, linealidad, exactitud y precisión. El método validado se utilizó en el diagnóstico de las aminoacidemias en pacientes pediátricos con sospecha clínica de la enfermedad. También se empleo para realizar el seguimiento bioquímico de los pacientes diagnosticados, con el fin de evaluar la eficacia del tratamiento dietético. 0.99 and r2> 0.98), accurate (% recovered 90-106% and % recovered CV <15%) and precise (% CV">Resultados: El método es específico para los aminoácidos evaluados, es lineal en los rangos de concentración evaluados para cada aminoácido (r> 0,99 y r2> 0,98), exacto (% recobrado 90-106% y % CV recobrado <15%) y preciso (%CV <15%). La introducción del método en el laboratorio permitió el diagnóstico de la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce en tres pacientes y de la hiperglicinemia no cetósica en cinco pacientes. Conclusiones: El método por HPLC para la cuantificación simultánea de aminoácidos en suero cumplió con los criterios de validación para los métodos bioanalíticos y su introducción permitió el diagnóstico de aminoacidemias.